近期，我所兽医生物技术国家重点实验室猪免疫抑制病研究创新团队利用CRISPR系统，在伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）组装的过程中实现了量子点对病毒核酸的原位标记，并系统的分析了PRV在Vero细胞和HeLa细胞中的侵染过程。相关论文“Single Virus Tracking with Quantum Dots Packaged into Enveloped Viruses Using CRISPR”在线发表于美国化学会权威期刊Nano Letters（影响因子12.279）上。

　　用量子点标记病毒颗粒，通过单病毒示踪技术“可视化”研究病毒对宿主细胞的相互作用，有助于深入研究病毒的侵染机制。对囊膜病毒而言，囊膜蛋白在病毒侵染的初期需要识别宿主细胞表面特定的受体，在囊膜上修饰量子点很有可能会影响到病毒对宿主细胞的侵染性。因此，标记病毒内部核酸可以最大程度的还原病毒与宿主细胞间的相互作用，还可以对病毒脱去囊膜后的行为进行示踪，为病毒致病机制的研究提供更为准确的信息。然而如何对病毒核酸进行标记一直是研究的难题。在CRISPR系统中，Cas9蛋白中两个氨基酸（D10A, H840A）的突变可以使其内切酶活性失活（Cell, 2013, 155: 1479-1491），这意味着gRNA结合靶序列后内切酶活性失活的Cas9蛋白（nuclease-deactivated Cas9, dCas9）不会对其进行剪切。

　　研究人员将生物素化的dCas9、PRV特异性的gRNA和链霉亲和素修饰的量子点（SA-QDs）转染进入细胞，然后再用PRV感染该细胞。在dCas9和gRNA的帮助下，量子点可以与细胞内的病毒核酸特异性结合，随着病毒的组装，即可将标记在核酸上的量子点包载进入病毒中（图1）。标记后的量子点荧光性质和病毒活性并未受到显著影响。

　　图1. 基于CRISPR系统的量子点原位标记PRV核酸策略示意图

　　随后，研究人员利用单病毒示踪技术分别观察并分析了PRV在Vero细胞和HeLa细胞中入胞、膜融合、胞内运输、基因组入核等动态过程。在Vero细胞中，PRV通过膜融合释放病毒核衣壳进入细胞，在胞内沿着微管运输，当病毒核衣壳运输至细胞核孔后，病毒核酸释放进入细胞核。在HeLa细胞中PRV的侵染过程则截然不同，病毒首先沿着肌动蛋白微丝移动到细胞膜上，然后形成巨胞饮小体内吞进入胞内，其在胞内的运输依然是依赖于微管；随后巨胞饮小体将病毒颗粒递送到溶酶体内，PRV核衣壳在溶酶体内通过膜融合的形式释放进入细胞质中，并继续运输到细胞核孔处，最后将病毒核酸释放入核（图2）。这些研究结果为深入揭示PRV的致病机制提供新的参考信息。

　　图2. PRV在Vero细胞和HeLa细胞中侵染过程示意图

　　杨勇博博士为论文的第一作者，安同庆研究员和蔡雪辉研究员为共同通讯作者。本研究得到了中国博士后基金（2018M630236），黑龙江省杰出青年基金（JC2017010）和黑龙江省自然科学基金（C2018069）的支持。

文章链接：https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.9b05103