近日，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室王晓钧团队首次揭示了猪作为流感病毒“混合器”的分子机制，证明了宿主蛋白ANP32A是猪支持禽流感病毒复制所必需的宿主因子，并明确了其与禽源聚合酶相互作用的关键位点。相关研究成果以“A unique feature of swine ANP32A provides susceptibility to avian influenza virus infection in pigs”为题于2020年2月21日发表于国际病原学专业学术期刊PLoS Pathogens。

　　A 型流感病毒是引起人和动物流感的主要病原，对人类的生命健康和社会生活形成巨大威胁。猪一直被认为是人、禽、猪流感的“混合器”，是促进禽流感与其它物种流感发生基因重排进而引起流感大流行的重要中间宿主。已知的1918、1957、1968和2009年4次全球性流感大流行都与禽源和其它物种流感病毒的基因重组密切相关。由于宿主种属屏障作用，禽流感病毒很难直接传播到人，但其可轻易传播到猪。禽流感病毒跨种间传播需要突破两个屏障，即血凝素（HA）结合受体类型和病毒RNA聚合酶的适应。猪的细胞表面已被证实兼具有人、禽流感病毒结合的受体，这确立了流感病毒感染的第一步。但关于禽流感病毒RNA聚合酶在猪体内的适应机制目前并不明确。

　　流感病毒的RNA聚合酶主要负责病毒基因组的转录与复制，在病毒的跨物种传播中发挥重要作用。禽流感病毒聚合酶的活性在哺乳动物细胞中一般是受限的，其无法在人及其它哺乳动物细胞中进行有效复制，禽流感病毒跨物种传播到哺乳动物，往往需要在PB2等聚合酶亚基上发生一些如E627K等的特定位点突变，聚合酶亚基突变后的病毒具有了在哺乳动物细胞中复制的能力。然而已有的研究显示，禽流感病毒可直接在猪源组织或细胞中发生有效复制而不需发生哺乳动物适应性点突变，这提示猪体内存在特殊的分子机制来支持禽流感病毒聚合酶的复制。

　　王晓钧团队前期研究已经证明宿主ANP32A&B蛋白是不同物种流感病毒聚合酶发挥功能的决定性宿主蛋白。在此基础上，该团队进一步利用聚合酶双荧光报告系统，检测了不同物种ANP32A&B蛋白对人、禽、猪、犬、马等不同物种流感病毒的支持作用，结果提示，相较于其他哺乳动物ANP32A或ANP32B蛋白，猪ANP32A（swANP32A）蛋白能够特异性支持禽源H7N9及H9N2亚型流感病毒聚合酶活性（图1）。免疫共沉淀结果提示，与人ANP32A（huANP32A）相比，swANP32A能特异性与禽源聚合酶复合体结合，从而支持禽源聚合酶的活性。为进一步确认swANP32A的功能，该团队构建了猪源PK15细胞ANP32A敲除细胞系（AKO-PK15），聚合酶活性分析及流感病毒感染实验证明，swANP32A的缺失导致聚合酶活性剂病毒复制滴度显著下降，提示ANP32A是猪源PK15细胞可以特异性支持禽流感病毒复制的关键因子。

　　图1 不同物种ANP32蛋白对不同物种A型流感病毒的支持活性分析

　　已有的研究报道显示禽源流感病毒聚合酶活性依赖于禽源ANP32A上所特有的33个氨基酸的插入片段，而序列比对分析显示swANP32A不具有禽源ANP32A支持禽流感病毒复制的关键功能域，即在LRRs与LCAR 区域之间无33个氨基酸插入序列。进一步的氨基酸序列分析提示swANP32A存在一些氨基酸点突变。通过定点突变结合聚合酶活性分析，明确了swANP32A蛋白的106V/156S位点是其发挥支持禽源聚活性的关键位点，也是影响其与禽源聚合酶复合物结合的关键位点。

　　该研究首次从宿主因子角度分析猪作为中间宿主支持禽流感病毒的分子机制，阐明了宿主蛋白ANP32A是支持禽流感跨物种传播到猪的关键因子，并明确了swANP32A蛋白的关键活性位点106V/156S，为新型抗流感药物和转基因动物的研发提供有效靶点（图2）。

　　王晓钧团队成员张海丽博士为文章第一作者，王晓钧研究员为通讯作者。该研究得到国家自然基金委创新群体项目（31521005）和黑龙江省自然科学基金（JC2018010）的资助。

原文链接：https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1008330

　　图2 猪作为流感病毒中间宿主的分子机制模式图